Fosforilazione ossidativa

  • ATP sintasi
  • coenzima Q (CoQ)
  • accoppiamento chimicosmotico
  • cristae
  • citocromo b-c complesso
  • citocromo c
  • citocromo ossidasi
  • catena di trasporto degli elettroni (ETC)
  • subunità F0
  • subunitàF1
  • spazio intermembrana spazio
  • matrice
  • NADH deidrogenasi
  • fosforilazione ossidativa
  • forza motrice protonica (PMF)
  • coppia redox
  • potenziale redox
  • catena respiratoria
  • succinato deidrogenasi
  • ubiquinone

Introduzione e obiettivi

Questo tutorial descriverà i meccanismi coinvolti nella sintesi dell’ATP durante la respirazione cellulare. La fase finale della respirazione cellulare avviene nei mitocondri, dove i portatori di elettroni ridotti (NADH e FADH2) donano i loro elettroni all’ossigeno attraverso una catena di trasporto degli elettroni. Mentre gli elettroni viaggiano, si genera un gradiente elettrochimico di idrogeno attraverso una delle due membrane mitocondriali. L’energia di questo gradiente elettrochimico di protoni è usata per sintetizzare ATP.

Alla fine di questo tutorial dovresti sapere:

  • La natura dell’accoppiamento chemiosmotico del trasporto di elettroni e della sintesi di ATP
  • Le caratteristiche di un mitocondrio
  • Il significato di potenziale redox e come esso determina il flusso di elettroni
  • I meccanismi del trasporto di elettroni (incluso il ruolo dei trasportatori di elettroni ridotti NADH e FADH2, e dell’ossigeno)
  • Come si forma il gradiente elettrochimico dell’idrogeno
  • Come il gradiente elettrochimico dell’idrogeno viene usato per sintetizzare l’ATP

L’accoppiamento chemiosmotico del trasporto di elettroni e della sintesi di ATP

La maggior parte dell’ATP cellulare viene sintetizzata durante la respirazione cellulare nei mitocondri delle cellule animali e vegetali, e durante la fotosintesi nei cloroplasti delle cellule vegetali e algali. Il meccanismo di sintesi dell’ATP in questi due organelli è molto simile e rappresenta un meccanismo evolutivamente conservato (che anche i batteri utilizzano). Fondamentalmente questo meccanismo è costituito da due processi collegati: il trasporto di elettroni e la sintesi di ATP (entrambi sono mediati da proteine legate alla membrana). Gli elettroni sono trasferiti lungo una catena di trasporto degli elettroni (ETC) che è composta da complessi proteici incorporati in una membrana. Mentre gli elettroni si spostano da una proteina all’altra, i protoni vengono pompati attraverso la membrana. Questo si traduce in un gradiente protonico elettrochimico, dove l’energia libera rilasciata durante il movimento degli elettroni è catturata in questo gradiente. Gli ioni idrogeno ritornano poi attraverso la membrana (lungo il gradiente elettrochimico) attraverso un complesso proteico specializzato chiamato ATP sintasi, che cattura l’energia libera del gradiente di idrogeno per guidare la sintesi di ATP da ADP e fosfato inorganico. Il collegamento tra trasporto di elettroni, pompaggio di protoni e sintesi di ATP è definito accoppiamento chemiosmotico. Nei mitocondri questo processo è lo stadio finale della respirazione cellulare e viene chiamato fosforilazione ossidativa. Nei cloroplasti questo processo è spesso indicato come le reazioni di luce della fotosintesi. Questo tutorial descriverà la fosforilazione ossidativa in dettaglio. La fotosintesi sarà descritta nel prossimo tutorial.

La fosforilazione ossidativa avviene nei mitocondri

Figura 1. La struttura di un mitocondrio. Un mitocondrio ha due membrane: una interna e una esterna. Lo spazio circondato dalla membrana interna è chiamato matrice, e le invaginazioni della membrana interna sono chiamate cristae. Lo spazio tra la membrana interna e quella esterna è chiamato spazio intermembrana. Le proteine che mediano i processi di fosforilazione ossidativa, compreso il trasporto di elettroni e la sintesi di ATP, sono incorporate nella membrana interna.

La completa ossidazione del glucosio in CO2 avviene durante la glicolisi e il ciclo dell’acido citrico (entrambi descritti nel precedente tutorial); si può ricordare che pochissima energia, sotto forma di ATP, viene effettivamente prodotta in queste due vie (vedi Fig. 5; nel tutorial Glicolisi, fermentazione e ciclo dell’acido citrico). La maggior parte dell’energia, a questo punto, è immagazzinata nei portatori di elettroni ridotti NADH e FADH2. Essi saranno utilizzati nella fase finale della respirazione cellulare, cioè la fosforilazione ossidativa, che avviene nei mitocondri. Un mitocondrio è un organello circondato da due membrane (una interna e una esterna; Figura 1). Queste due membrane definiscono lo spazio intermembrana, e la matrice (lo spazio interno del mitocondrio) è definita dalla membrana interna. La membrana esterna è molto permeabile e permette a molte molecole di entrare e uscire dal mitocondrio. La membrana interna, che è molto meno permeabile, è il luogo della fosforilazione ossidativa. Le proteine dell’ETC e dell’ATP sintasi sono incorporate nella membrana interna, che ha numerosi ripiegamenti distinti (chiamati cristae). Le criste aumentano la superficie della membrana interna. La matrice è il sito del ciclo dell’acido citrico. I mitocondri contengono anche il loro genoma e possono trascrivere mRNA e tradurre proteine.

Potenziale Redox

Figura 2. La catena di trasporto degli elettroni. Il trasferimento di elettroni da un trasportatore di elettroni ridotto a un altro trasportatore di elettroni nell’ETC è mostrato come funzione dell’energia libera di trasferimento di elettroni da quel trasportatore di elettroni all’ossigeno. Questa è calcolata come la differenza tra il potenziale redox del singolo trasportatore di elettroni (per esempio NADH) e il potenziale redox dell’ossigeno. Il flusso di elettroni avviene in modo graduale, rilasciando l’energia libera in modo incrementale.

Nella fosforilazione ossidativa, i portatori di elettroni ridotti (NADH e FADH2) donano i loro elettroni alle proteine dell’ETC. Gli elettroni passano da proteina a proteina in modo graduale, accoppiati al pompaggio di protoni attraverso la membrana mitocondriale interna, nello spazio intermembrana. Alla fine gli elettroni sono donati all’ossigeno per formare acqua, da cui la necessità di ossigeno nella respirazione cellulare. La direzione del flusso di elettroni lungo l’ETC è determinata dall’affinità dei diversi vettori per gli elettroni. Questa affinità può essere espressa come potenziale redox, una misura empirica dell’affinità di qualsiasi coppia di composti ossidati e ridotti (coppia redox) per gli elettroni. Per esempio, la reazione NAD+ + 2H+ + 2e- -> NADH (NADH e NAD+ sono la coppia redox) ha un potenziale redox di -320mV; questo valore negativo indica che NADH è un buon donatore di elettroni (ha un’affinità relativamente bassa per gli elettroni). Al contrario, la reazione 1/2 O2 + 2H+ + 2e- -> H2O ha un potenziale redox di +820mV, indicando che l’ossigeno è un eccellente accettore di elettroni (ha un’alta affinità per gli elettroni). Nell’ETC, la direzione del flusso di elettroni è dai composti con potenziali redox più bassi ai composti con potenziali redox successivamente più alti; cioè, iniziando con NADH o FADH2 e terminando con l’ossigeno (vedi Figura 2). Quando gli elettroni vengono passati da un donatore di elettroni (per esempio NADH) a un accettore di elettroni (per esempio O2), l’energia libera rilasciata può essere calcolata dalla differenza tra il potenziale redox di una coppia redox (per esempio NADH e FADH2).NADH e NAD+) e l’altra coppia redox.

La catena respiratoria

Figura 3. Fosforilazione ossidativa: trasporto di elettroni e sintesi di ATP. La catena respiratoria è composta da tre grandi complessi proteici fissati nella membrana (colorati in arancione) e da due trasportatori di elettroni mobili (colorati in nero). Gli elettroni sono donati dal NADH alla NADH deidrogenasi, un grande complesso proteico che pompa protoni attraverso la membrana interna. Poi, gli elettroni sono trasportati al complesso del citocromo b-c attraverso la piccola molecola mobile del coenzima Q (Q), chiamata anche ubichinone; anche il complesso del citocromo b-c pompa protoni attraverso la membrana interna. Questi elettroni sono consegnati all’ultimo complesso proteico, il citocromo ossidasi, dalla proteina mobile citocromo c (cyt c). Il citocromo ossidasi dona gli elettroni all’ossigeno e si forma l’acqua. La citocromo ossidasi pompa anche protoni attraverso la membrana. La concentrazione di idrogeno è molto maggiore nello spazio intermembrana che nella matrice, generando così un gradiente protonico elettrochimico. Questo gradiente spinge i protoni indietro attraverso la membrana interna attraverso l’ATP sintasi (mostrato in grigio) che catalizza la sintesi dell’ATP dall’ADP e dal fosfato inorganico (Pi).

La catena di trasporto degli elettroni mitocondriale, chiamata anche catena respiratoria, è organizzata in tre complessi multiproteici: NADH deidrogenasi, complesso del citocromo b-c e citocromo ossidasi. Ogni complesso della catena respiratoria è composto da diverse proteine in grado di trasportare elettroni e pompare protoni attraverso la membrana interna, generando così un gradiente protonico elettrochimico (illustrato nella Figura 3). Le proteine all’interno di questi complessi hanno una varietà di gruppi prostetici (vedi il tutorial Proprietà delle macromolecole 1-Proteine), compresi i centri ferro-zolfo, gli emi, le flavine (le società ad anelli multipli dei FAD) e il rame, che sono tutti capaci di accettare e donare elettroni. Il trasporto di elettroni viene avviato quando una coppia di elettroni e un protone vengono rilasciati dal NADH e accettati dalla NADH deidrogenasi, dopodiché gli elettroni vengono trasportati da una proteina all’altra all’interno del complesso. Gli elettroni sono poi trasportati da quel complesso al complesso del citocromo b-c dal trasportatore mobile di elettroni coenzima Q (CoQ), chiamato anche ubichinone, l’unico trasportatore di elettroni non proteico nella catena respiratoria. Gli elettroni si muovono attraverso il complesso del citocromo b-c e sono trasportati al complesso finale dalla piccola proteina citocromo c. Il complesso finale, il citocromo ossidasi, catalizza il trasferimento degli elettroni all’ossigeno. L’energia libera di questa reazione completa (NADH + H+ + 1/2 O2 -> NAD+ + H2O) è -52,6 kcal/mol. L’energia libera viene rilasciata in modo graduale man mano che gli elettroni si muovono attraverso l’ETC, e viene catturata nel gradiente protonico elettrochimico. FADH2 dona anche i suoi elettroni alla catena respiratoria, ma poiché il suo potenziale redox è più alto di quello della NADH deidrogenasi, non può donare i suoi elettroni a quel complesso proteico. Invece, gli elettroni da FADH2 sono donati alla succinato deidrogenasi, che, a sua volta, passerà gli elettroni al CoQ e saranno trasportati attraverso il resto della catena respiratoria. Il gradiente elettrochimico dell’idrogeno che si genera durante il trasporto di elettroni iniziato dal FADH2 non è così grande come quello generato dal NADH. Questo perché FADH2 dona i suoi elettroni alla succinato deidrogenasi, che non pompa protoni, e gli elettroni bypassano la NADH deidrogenasi, che pompa protoni.

Il gradiente elettrochimico protonico

Coordinatamente al trasporto di elettroni, i tre complessi proteici respiratori descritti sopra pompano protoni dalla matrice nello spazio intermembrana, generando un gradiente elettrochimico attraverso la membrana interna. Mentre gli elettroni si muovono attraverso questi complessi multiproteici, sono spesso accoppiati con un protone (H+) per neutralizzare la loro carica mentre si spostano da un lato all’altro della membrana. I cambiamenti allosterici nei complessi proteici possono anche provocare il pompaggio di protoni attraverso la membrana. Il pompaggio dei protoni genera un gradiente attraverso la membrana interna di una differenza di unità di pH (una differenza di dieci volte nella concentrazione di ioni idrogeno) tra la matrice e lo spazio intermembrana. Inoltre, si genera un potenziale di membrana dovuto a una carica positiva nello spazio intermembrana e alla carica negativa netta nella matrice. Il gradiente elettrochimico attraverso la membrana interna è composto sia dal gradiente di pH che dal potenziale di membrana ed è la forza, spesso indicata come forza motrice protonica (PMF), che spinge i protoni attraverso la membrana interna nella matrice e, così facendo, guida la sintesi di ATP.

ATP sintasi

Figura 4. La struttura dell’ATP sintasi.L’ATP sintasi è composta da due subunità: F0 e F1. Ciascuna di queste subunità è composta da più proteine. La subunità F0 è composta da proteine integrali di membrana: 1 copia della proteina a; 2 copie della proteina b; e tra 12-14 copie della proteina c, che forma il canale per il flusso di protoni attraverso la membrana. La subunità F1 è composta da cinque proteine distinte: 3 copie di alfa, 3 copie di beta, 1 copia di gamma, delta ed epsilon. Quando i protoni attraversano la membrana, le subunità c e le subunità delta ed epsilon attaccate ruotano. Il resto delle subunità sono stazionarie. Quando i protoni entrano, l’anello formato dalle subunità c e il gambo (composto dalle subunità delta ed epsilon) ruotano. Questa rotazione induce dei cambiamenti conformazionali nelle subunità beta, catalizzando la sintesi di ATP.

La PMF è usata per guidare la sintesi di ATP attraverso l’ATP sintasi, un complesso proteico che converte l’energia del gradiente protonico in legami chimici. L’ATP sintasi ha due subunità distinte: la subunità transmembrana F0, che contiene un canale proteico per il flusso di protoni; e la subunità F1, che sporge nello spazio della matrice e catalizza la sintesi di ATP da ADP e fosfato inorganico (Figura 4). Una porzione della subunità F1, chiamata gambo, collega le due subunità. Quando i protoni scorrono attraverso il canale nella subunità F0, causano la rotazione del peduncolo incorporato nella subunità F1 stazionaria, convertendo così l’energia del gradiente elettrochimico in energia meccanica. Mentre il peduncolo ruota in una direzione, induce cambiamenti conformazionali nelle proteine della subunità F1, che, a loro volta, catalizzano la sintesi di ATP – convertendo così l’energia meccanica della rotazione del peduncolo in energia di legame chimico. Circa tre protoni devono passare attraverso il complesso dell’ATP sintasi per sintetizzare una molecola di ATP.

Il gradiente protonico come collegamento tra il trasporto di elettroni e la sintesi di ATP

Il gradiente protonico è fondamentale per l’accoppiamento chemiosmotico del trasporto di elettroni e della sintesi di ATP. Mentre gli elettroni vengono spostati lungo la catena respiratoria, i protoni vengono pompati attraverso la membrana interna, dalla matrice nello spazio intermembrana; questo provoca un gradiente protonico elettrochimico. La forza di questo gradiente spinge i protoni indietro attraverso la membrana interna nella matrice, attraverso la subunità F0 dell’ATP sintasi, che ha come risultato l’attivazione delle subunità F1 e la sintesi di ATP. In media, per ogni NADH, vengono sintetizzati circa 3 ATP, e per ogni FADH2, vengono sintetizzati circa 2 ATP. La resa inferiore di ATP per il FADH2 deriva dal minore gradiente protonico generato quando gli elettroni sono donati dal FADH2. In questo caso, gli elettroni sono donati alla succinato deidrogenasi, che non pompa protoni quando gli elettroni entrano nell’ETC, bypassando così la NADH deidrogenasi e i protoni che pomperebbe attraverso la membrana.

Sommario

La fosforilazione ossidativa è un meccanismo per la sintesi di ATP sia nelle cellule vegetali che animali. Comporta l’accoppiamento chemiosmotico del trasporto di elettroni e della sintesi di ATP. La fosforilazione ossidativa avviene nei mitocondri. Il mitocondrio ha due membrane: una interna e una esterna. Lo spazio definito dalla membrana interna è la matrice, e lo spazio tra le due membrane è lo spazio intermembrana. NADH e FADH2, generati nella glicolisi e nel ciclo dell’acido citrico, sono ossidati nei mitocondri. Essi donano i loro elettroni a complessi proteici incorporati nella membrana interna mitocondriale, composti da molti polipeptidi con una varietà di gruppi prostetici in grado di accettare e donare elettroni. Questi complessi sono componenti della catena respiratoria. Gli elettroni donati da NADH e FADH2 sono trasportati lungo la catena respiratoria e alla fine saranno donati all’ossigeno, generando così acqua. La direzione del trasporto di elettroni è determinata dal potenziale redox di ogni potenziale trasportatore di elettroni. Ci sono tre grandi complessi proteici che partecipano alla catena respiratoria che trasporta elettroni e che pompano ioni idrogeno attraverso la membrana interna, dando luogo a un gradiente elettrochimico di idrogeno. Questo gradiente elettrochimico genera una forza motrice protonica (PMF) che spinge gli ioni di idrogeno indietro attraverso la membrana interna attraverso l’ATP sintasi. L’ATP sintasi è composta da due subunità: la subunità F0, che fornisce un canale per il flusso di ioni idrogeno attraverso la membrana interna, e la subunità F1, che catalizza la sintesi di ATP da ADP + Pi. Quando gli ioni idrogeno scorrono attraverso la subunità F0, una parte della subunità ruota nella membrana. Mentre ruota, induce cambiamenti conformazionali nella subunità F1 che attivano l’attività di sintesi dell’ATP, convertendo così l’energia libera del gradiente elettrochimico dell’idrogeno (generato dalle proteine della catena di trasporto degli elettroni) nell’energia di un legame chimico.

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